CRISPR / Cas đã cách mạng hóa kỹ thuật bộ gen của các hệ thống sinh học do thiết kế dễ dàng, tính đặc hiệu của trang đích và khả năng mở rộng cho các ứng dụng thông lượng cao. Nó cho phép xóa gen, tăng cường hoặc ức chế biểu hiện gen in vitro và in vivo. Các thành phần của hệ thống CRISPR / Cas (bao gồm các RNA dẫn hướng) thường được mã hóa trên các vectơ biểu hiện ngoại bào lớn (9 Biệt19 kb) được đưa vào các tế bào thông qua quá trình truyền. Do kích thước lớn, các vectơ này nổi tiếng là khó truyền và gây chết tế bào cao, cấm các phân tích xuôi dòng 1 , 2 .
Sự phát triển phương pháp thay đổi tế bào đã dẫn đến các vec tơ virus (sinh học) 3 an toàn hơn , các polyme và lipit mới (hóa học) 4 và các thiết bị phân phối hạt (vật lý) 4 . Phân phối qua trung gian virus (tải nạp) dẫn đến hiệu quả cao nhất nhưng đòi hỏi các thiết lập phòng thí nghiệm ở mức độ an toàn sinh học cao hơn và phê duyệt đạo đức khi được sử dụng trong nghiên cứu hoặc trong phòng khám 5 . Chúng tôi đã khắc phục những hạn chế của các quá trình chuyển đổi dựa trên cơ chế điện hiện tại bằng cách thêm một lượng nhỏ các vectơ nhỏ (~ 3 kb) vào lớn (91515 kb), giúp tăng hiệu quả truyền và khả năng sống của tế bào. Do thực hiện dễ dàng trong các giao thức truyền hiện tại, chiến lược này có thể được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu cơ bản và ứng dụng.
Truyền máu tiêu chuẩn thông qua điện di của vec tơ CRISPR-GFP 15 kb vào các tế bào ung thư phổi ở người khó truyền (A549) cho thấy hiệu quả truyền máu rất thấp (4.2%) và tử vong tế bào cao (91%). Ngược lại, việc đồng bộ hóa khối lượng bằng nhau của một vectơ trống nhỏ (3 kb) cùng với vectơ CRISPR-GFP lớn (15 kb) làm tăng đáng kể hiệu quả truyền máu (40%) và giảm chết tế bào (45%).
Tiếp theo chúng tôi đã kiểm tra xem kích thước của vectơ nhỏ có ảnh hưởng đến hiệu quả của việc truyền bằng cách sử dụng một phạm vi các vectơ nhỏ (1,8 Th6,5 kb). Tính trung bình, sự đồng bộ của vectơ CRISPR-GFP lớn với các vectơ nhỏ đã tăng hiệu suất truyền lên 12,2% (thay đổi 4,9 lần) và khả năng sống của tế bào lên 16,6% (thay đổi 1,9 lần). Trong tất cả các vectơ được thử nghiệm, vectơ nhỏ 3 kb cho thấy mức tăng hiệu suất truyền cao nhất (trung bình tăng 21,4% hoặc 6,8 lần). Bên cạnh đó, thâm chuyển của vectơ chỉ nhỏ không đáng kể khả năng di động của alter làm khi so sánh với thâm chuyển mock (cặp hai đuôi t-test, p -value> 0,05). Vì tất cả các vectơ nhỏ đều cải thiện hiệu quả truyền, chúng tôi suy đoán rằng phương pháp của chúng tôi đã được sử dụng một cách vô tình khi đồng truyền các gRNA và các thành phần CRISPR / Cas trên các vectơ riêng biệt 6 . Việc truyền các tế bào với số lượng vectơ CRISPR-GFP ngày càng tăng (15 kb, 0 mộc7.5 Thayg) không dẫn đến sự gia tăng các tế bào GFP + mà dẫn đến số lượng tế bào chết cao hơn. Việc đồng bộ một lượng cố định của vectơ nhỏ (3 kb, 5 HP) đã tăng số lượng tế bào GFP + một cách nhất quán (trung bình thay đổi 4,3 lần) và tăng số lượng tế bào khả thi (trung bình thay đổi 1,9 lần). Điều này cho thấy rằng kích thước nhưng không phải là lượng vectơ lớn ảnh hưởng đến hiệu quả truyền máu.
Để xác thực xem sự gia tăng hiệu quả truyền và khả năng sống của tế bào có phụ thuộc vào kích thước của các vectơ CRISPR lớn hay không, chúng tôi đã điều hòa các ô với một loạt các vectơ GFP khác nhau (6,5 .15 kb). Chúng tôi đã tìm thấy sự giảm dần hiệu quả truyền máu (từ khoảng 25 đến 4%) và khả năng sống của tế bào (từ khoảng 36 đến 15%) với việc tăng kích thước vectơ GFP. Sự phụ thuộc kích thước vectơ này vào hiệu quả truyền có thể được xem xét khi thiết kế các vectơ CRISPR trong tương lai. Đáng chú ý, hiệu quả truyền và khả năng sống của tế bào được cải thiện đáng kể khi đồng bộ hóa vectơ nhỏ (3 kb) với tất cả các vectơ GFP được thử nghiệm. Nhìn chung, chúng tôi đã tìm thấy mức tăng trung bình về hiệu suất thay đổi là 15% (phạm vi: 6 Tắt25%) bất kể kích thước của vectơ GFP. Ngoài ra, biểu hiện GFP trong các tế bào đã được thay thế bằng một vec tơ CRISPR-GFP lớn (15 kb) với sự có mặt của các plasmid nhỏ (3 kb) cho thấy sự tăng cường ổn định về hiệu quả truyền máu kéo dài trong vài ngày (6 h đến 4d sau khi truyền).
Các dòng tế bào người có nguồn gốc từ bệnh nhân đã được sử dụng mạnh mẽ trong nghiên cứu để điều tra các cơ chế phân tử giải thích các bệnh cũng như xác định và thử nghiệm các hợp chất dược phẩm cho mục đích điều trị trong các điều kiện được xác định rõ và tái sản xuất. Hơn nữa, các tế bào chính từ máu ngoại vi phân lập từ bệnh nhân có thể được biến đổi gen và được sử dụng làm liệu pháp miễn dịch trong các ứng dụng lâm sàng. Để xác định liệu phương pháp của chúng tôi có thể được sử dụng trong các loại tế bào chính được nghiên cứu chuyên sâu, khó truyền hoặc khác, chúng tôi đã ghép các vectơ nhỏ (3 kb) và lớn (15 kb) để đo lường hiệu quả của sự thay đổi và sự sống của tế bào Các dòng tế bào ung thư kết dính và không kết dính (Huh7 và HepG2 (gan), PC3 (tuyến tiền liệt), MCF7 (vú), HEK293 (thận), A549 (phổi), SH-SY5Y (tế bào thần kinh),HL-60 (bệnh bạch cầu)) cũng như các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) và tế bào T CD8 tinh khiết. Theo các quan sát trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã xác nhận sự cải thiện nhất quán về hiệu quả thay đổi (lên tới 36%) và khả năng sống của tế bào (lên tới 46%) trong tất cả các dòng tế bào được thử nghiệm. Trái ngược với các tế bào tuân thủ, các tế bào trong hệ thống treo có hiệu suất truyền rất thấp, có thể được cải thiện khi tối ưu hóa thêm các cài đặt điện. Tuy nhiên, việc đồng bộ với vectơ nhỏ tuy nhiên đã cải thiện số lượng tế bào GFP + nhưng không làm tăng khả năng sống của tế bào. Nhìn chung, chúng tôi nhận thấy rằng tỷ lệ tăng của các tế bào biến đổi tích cực tương quan cao với tỷ lệ tế bào khả thi, cho thấy phương thức hoạt động của vectơ nhỏ là cải thiện khả năng tồn tại của các tế bào được chuyển hóa tích cực. Để hiểu rõ hơn về cơ chế cơ bản, chúng tôi đã kiểm tra phụ thuộc của hiệu quả thâm chuyển trên cấu tạo vector nhỏ. Tuyến tính hóa vectơ nhỏ không dẫn đến bất kỳ sự khác biệt nào về hiệu suất truyền khi so sánh với phiên bản tròn của nó, cho thấy rằng các plasmid tròn và tuyến tính đều có khả năng tăng cường hiệu quả của quá trình truyền. Chúng tôi cũng đã xem xét nội dung và các đặc điểm của chuỗi vectơ và thấy rằng cả hàm lượng GC cũng như các họa tiết cụ thể trong DNA được mã hóa của vectơ nhỏ đều cải thiện hiệu quả của việc truyền máu.
Cuối cùng, chúng tôi đã thử nghiệm phương pháp của chúng tôi trong các phương pháp thay thế hóa học. Chúng tôi đã sử dụng Lipofectamine 3000 thường được sử dụng và tạo ra các liposome chứa vec tơ CRISPR-GFP lớn (15 kb) khi có và không có vectơ nhỏ (3 kb). Tương tự như các kết quả thu được sau khi điện hóa, việc bổ sung các hiệu suất thay đổi vectơ nhỏ tăng cường trong tất cả các loại tế bào được thử nghiệm. Tuy nhiên, trái ngược với sự thay đổi dựa trên cơ chế điện, việc đưa vectơ nhỏ vào trong liposome làm giảm nhẹ khả năng sống sót.
Chúng tôi cho rằng các vectơ nhỏ có thể nhanh chóng vượt qua màng tế bào và hạt nhân và các vectơ lớn có thể di chuyển trên dòng vectơ nhỏ này vào trong tế bào. Bằng cách di chuyển cùng với các vectơ nhỏ, các vectơ lớn hơn có thể xâm nhập vào tế bào mà không bị vướng vào hai hoặc nhiều lỗ chân lông mở, đảm bảo sự hấp thu plasmid thích hợp và ngả màng do đó ngăn ngừa chết tế bào 7 . Mô hình này sẽ giải thích các kết quả mà chúng tôi thu được bằng cách sử dụng điện di động của các tế bào kết dính, nhưng nó giải thích cả khả năng sống kém của các tế bào huyền phù cũng như lý do tại sao vectơ nhỏ cải thiện hiệu quả chuyển hóa liposome. So với các tế bào kết dính, các tế bào lơ lửng thường nhỏ hơn và chưa trải qua quá trình cố gắng. Trypsinization cắt các liên kết kéo dài màng của các tế bào kết dính và do đó có thể dẫn đến một cấu trúc màng nhỏ gọn hơn và thoải mái hơn. Điều này có thể tạo điều kiện cho sự hình thành các lỗ màng lớn hơn sau khi điện hóa, cho phép khả năng tiếp cận tốt hơn của các plasmid nhỏ và do đó làm mịn màng đi qua của các vectơ lớn hơn. Sự khác biệt về cái chết của tế bào sau khi đồng bộ với các vectơ nhỏ có thể được giải thích thêm bằng các phản ứng khác nhau của cảm biến DNA kích hoạt cái chết tế bào được lập trình 8 . Cảm biến DNA có thể trơ khi phản ứng với các plasmid nhỏ nhưng hoạt động mạnh khi cảm nhận các plasmid lớn. Tuy nhiên, hiện tượng này là đầu cơ, và cần nhiều công việc sinh lý hơn để giải quyết cơ chế chính xác cơ bản.
Một cách tiếp cận khác cho chiến lược của chúng tôi trước đây đã được xuất bản 2 , 9 . Không giống như phiên mã hệ thống CRISPR / Cas9 bên trong tế bào chủ như chúng tôi đề xuất, một ribonucleoprotein CRISPR / Cas9 tái tổ hợp có thể được hình thành trong ống nghiệm trước khi điện di. Cách tiếp cận này mang lại hiệu quả truyền máu cao hơn trong các tế bào máu nguyên phát so với chúng tôi báo cáo. Tuy nhiên, một protein tái tổ hợp phải được sản xuất và các phức hợp ribonucleoprotein phải được điện hóa ngay sau khi hình thành. So với chiến lược này, cách tiếp cận của chúng tôi về việc thêm một vectơ nhỏ vào hỗn hợp biến đổi đơn giản hơn, rẻ hơn và ít tốn thời gian hơn.
Tóm lại, chúng tôi đã phát hiện ra rằng sự thay đổi tế bào dựa trên tế bào ung thư và lipofectamine của các dòng tế bào ung thư và các loại tế bào chính có thể được cải thiện bằng cách thêm một vec tơ nhỏ vào hỗn hợp thay thế. Vì công nghệ CRISPR được áp dụng phổ biến và sẽ tiếp tục phát triển hơn nữa, phương pháp thay thế tối ưu, đơn giản và không nguy hiểm của chúng tôi sẽ có nhiều ứng dụng trong y sinh học lâm sàng và công nghệ sinh học công nghiệp.
Các dòng tế bào ung thư HepG2, Huh7, PC3, SH-SY5Y, HEK293, MCF7, HL-60 và A549 được lấy từ Bộ sưu tập Văn hóa Kiểu Mỹ (ATCC). Tất cả các dòng tế bào đều không có mycoplasma khi được kiểm tra định kỳ bằng Mycoplasmacheck (Eurofins Genomics) hoặc MycoProbe (R & D). Các tế bào được nuôi cấy trong bình T-75 ở 37 ° C và 5% CO 2bầu không khí sử dụng môi trường bổ sung 1/100 Penicillin / Streptomycin (Sigma) và 10% huyết thanh bò bào thai (Hyclone). Huh7, HepG2, A549, HEK293 và MCF7 đã được nuôi cấy trong Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma) của Dulbecco, HL-60 được nuôi cấy tại Viện tưởng niệm Roswell Park (RPMI) 1640 (Sigma) và PC3 và SH-SY-5Y nuôi cấy trong môi trường DMEM: F-12 (1: 1) (Gibco). Để đảm bảo tính xác thực, các dòng tế bào ban đầu được tạo kiểu gen bằng cách lập hồ sơ di truyền lặp lại ngắn hạn (STR) bằng cách sử dụng bảng điều khiển PowerPlex_16HS_Cell Line và được phân tích bằng phần mềm Gene Mapper ID v3.2.1 của Nhà cung cấp bên ngoài Genetica DNA Laboratory Laboratory (LabCorp Special Laboratory Group) liên tục đánh giá kiểu hình. Các tế bào được phân chia ở mức hợp lệ ~ 70, 90% 90% bằng cách hút môi trường, rửa nhẹ nhàng bằng dung dịch muối đệm phốt phát (PBS,Sigma) và tách chúng ra với 3 ml dung dịch trypsin-EDTA (Sigma) trong 3 phút5 phút. Trypsin bị bất hoạt với lượng dư thừa tối thiểu 10 lần của môi trường nuôi cấy trước khi một phần tế bào được thông qua.
pLV hU6-sgRNA hUbC-dCas9-KRAB-T2a-GFP 10 (15.0 kb), FC3-GFP (6.2 kb), SpCas9 (BB) -2A-GFP-prickle (9.2 kb), pCAGGs 13,3 kb), pUC19-no-LacZ (1,8 bp), pUC19 (2,7 kb), pBlueScript (3.0 kb), pH6HTC (3.5 kb), pH6HTC-STMN (4.4 kb), pH6HTC-PKM (5.1 kb), pH6HTC CCT (5,6 kb), pH6HTC-CTCF (6,2 kb), pH6HTC-D9 (6,5 kb).
Các tế bào được điện hóa bằng hệ thống điện di NEON (Invitrogen). Một thời gian ngắn, các tế bào đã tăng lên 70 hợp lưu 90% 90% được thu hoạch và viên ở 500 g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Các tế bào đã được nối lại trong PBS, được đếm và quay xuống ở mức 500 g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Lượng DNA plasmid thích hợp được chuyển vào ống siêu nhỏ 1,5 ml vô trùng. Sau khi hút PBS từ các viên tế bào, các tế bào đã được nối lại trong Bộ đệm Resuspension R đến 1.0 × 10 7tế bào / mL. Các tế bào được trộn nhẹ nhàng để thu được một huyền phù tế bào và thêm vào ống chứa DNA plasmid. Các tế bào được trộn nhẹ nhàng với các plasmid mà không tạo ra bọt khí. Để tránh chết tế bào không cần thiết, các tế bào được điện hóa được mạ trực tiếp vào môi trường không có phenol đỏ được làm nóng trước mà không cần bất kỳ loại kháng sinh nào.
Việc truyền liposome được thực hiện với lipofectamine 3000 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tất cả các tế bào được mạ trong các tấm 24 giếng (110.000 / giếng HepG2 và MCF7, 70.000 / giếng Huh7 và 50.000 / giếng A549). Trộn 1: 25 OptL Opti-MEM (Gibco) + 1,5 LipL Lipofectamine 3000. Trộn 2: 25 μL Opti-MEM + 250 ng pBluescript + 250 ng GFP-vector + 1 μL P3000 thuốc thử.
Hiệu suất truyền được đo sau 24 giờ (trừ khi được quy định khác nhau) bằng phương pháp tế bào học dòng chảy (FACSNavios, Beckman Coulter, Navios Cytometry List Mode Data Data Acquirition and Software Software phiên bản 1.3) bằng cách ghép các ô cho GFP và 7AAD. Để thu thập tất cả các tế bào có khả năng chết, cả tế bào nổi và tế bào kết dính (được thu hoạch bằng cách thử) đã được thu thập. Các tế bào được rửa trong 1xPBS với 1% BSA (Sigma), sau đó nhuộm trong dung dịch đệm 100 withL với dung dịch nhuộm 5 5L 7AAD (eBioscience) trong 15 phút trên băng trong bóng tối. Các tế bào được thu nhận trực tiếp mà không rửa trôi bộ đệm nhuộm bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Trong một số thí nghiệm, hình ảnh kính hiển vi được chụp bằng Máy chụp ảnh huỳnh quang Zoe (Bio-Rad, phiên bản phần mềm 002.257.011215).
Áo khoác đệm được lấy từ các tình nguyện viên khỏe mạnh ẩn danh sau khi có sự đồng ý và theo hướng dẫn của tổ chức (Bệnh viện Đại học Karolinska, Stockholm, Thụy Điển). PBMC được phân lập bằng Ficoll-Paque (GE Health) như mô tả trước đây 11 . Các tế bào T CD8 được phân lập bằng cách sử dụng phân loại tế bào liên quan từ tính (Miltenyi) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các tế bào PBMC và CD8 T được nghỉ qua đêm ở nhiệt độ 37 ° C và 5% CO 2 trong RPMI được bổ sung 1/100 Penicillin / Streptomycin và 10% huyết thanh bò bào thai trước khi đốt điện.
Dữ liệu được vẽ và phân tích với GraphPad Prism (phiên bản 8.4.2), Microsoft Excel (phiên bản 16.37), R (phiên bản 3.6.1) và ggplot2 (phiên bản 3.3.0). Các bản sao được định nghĩa là các đoạn riêng lẻ của các dòng tế bào ung thư hoặc là các nhà tài trợ riêng lẻ cho các tế bào miễn dịch chính. Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình + hoặc ± SEM và kích thước mẫu được trình bày trong mỗi chú thích hình. Ý nghĩa thống kê của sự khác biệt giữa các nhóm được xác định bằng bài kiểm tra t của sinh viên hai đuôi. Giá trị p nhỏ hơn 0,05 ( p <0,05) được coi là có ý nghĩa thống kê.
Jonas Nørskov Søndergaard, Keyi Geng, Christian Sommerauer, Ionut Atanasoai, Xiushan Yin & Claudia Kutter
Communications Biology volume 3, Article number: 319 (2020)
References
1. Lesueur, L. L., Mir, L. M. & André, F. M. Overcoming the specific toxicity of large plasmids electrotransfer in primary cells in vitro. Mol. Ther. Nucleic Acids 5, e291 (2016).
2. Roth, T. L. et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature 559, 405–409 (2018).
3. Münch, R. C. et al. Displaying high-affinity ligands on adeno-associated viral vectors enables tumor cell-specific and safe gene transfer. Mol. Ther. 21, 109–118 (2013).
4. Hill, A. B., Chen, M., Chen, C. K., Pfeifer, B. A. & Jones, C. H. Overcoming gene-delivery hurdles: physiological considerations for nonviral vectors. Trends Biotechnol. 34, 91–105 (2016).
5. Schlimgen, R. et al. Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies. J. Occup. Environ. Med. 58, 1159–1166 (2016).
6. Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823–826 (2013).
7. Stewart, M. P., Langer, R. & Jensen, K. F. Intracellular delivery by membrane disruption: mechanisms, strategies, and concepts. Chem. Rev. 118, 7409–7531 (2018).
8. Maelfait, J., Liverpool, L. & Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. J. Mol. Biol. 432, 552–568 (2020).
9. Schumann, K. et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112, 10437–10442 (2015).
10. Thakore, P. I. et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nat. Methods 12, 1143–1149 (2015).
11. Søndergaard, J. N. et a. Dendritic cells actively limit interleukin-10 production under inflammatory conditions via DC-SCRIPT and dual-specificity phosphatase 4. Front. Immunol. 9, 1–13 (2018).
